Rotko muzeja krājums ir viena no kultūras un mākslas institūcijas lielākajām vērtībām. To veido vairāk nekā trīs tūkstoši vienību dažādos mākslas medijos. Astoņās krājuma apakškolekcijās kārtotie Latvijas un ārvalstu mākslinieku autordarbi nodrošina pasaules līmeņa mākslas pieejamību reģionā, apvienojot spilgtas laikmetīgās jaunrades un vecmeistaru izcilības liecības.

Mākslas krājuma kolekcijas ir veidojušās jau kopš 2003. gada, kad, svinot Dvinskā (tagad – Daugavpilī) dzimušā mākslinieka, abstraktā ekspresionisma pamatlicēja Marka Rotko simtgadi, mākslinieka ģimene dāvināja Daugavpilij četrdesmit retrospektīvas muzeja kvalitātes reprodukcijas. 2005. gadā pilsētā pirmo reizi norisinājās starptautiskais glezniecības plenērs “Marks Rotko”, kas kļuva par tradīciju un nemainīgu priekšnoteikumu krājuma turpmākai papildināšanai.

Rotko muzeja (līdz 2023. gadam – Daugavpils Marks Rotko mākslas centra) aktīvā starptautisko simpoziju un rezidenču programma piesaista Latvijas un pasaules laikmetīgās mākslas pārstāvjus un sekmē māksliniecisko jaunradi. Ik gadu muzeja krājumu papildina simpoziju dalībnieku dāvinājumi, paplašinot ģeogrāfiskās pārstāvniecības robežas un demonstrējot aktuālo māksliniecisko izpausmju daudzveidību. Mākslinieku individuālie dāvinājumi pēc izstādēm Rotko muzejā ir vēl viens būtisks krājuma papildināšanas veids un apliecinājums sekmīgai izstāžu projektu īstenošanai.

2018. gada nogalē tika noslēgts līgums ar mākslinieku un mākslas mecenātu Bazilu Alkaci (Basil Alkazzi, Lielbritānija) par Bazila Alkaci iepirkumu fonda (The Basil Alkazzi Acquisitions Fund) izveidi, kas ir ļāvis papildināt muzeja krājumu ar vērtīgiem Latvijas un ārvalstu gleznotāju un grafiķu darbiem.

Kultūrvēsturiska nozīme muzeja krājuma veidošanā ir memoriālo vērtību saglabāšanai un mākslas pēctecībai. Rotko muzejs mērķtiecīgi veido un glabā Daugavpilī dzimušu mākslinieku (Pētera Martinsona, Silvas Linartes, Sigurda Vīdzirkstes) memoriālās kolekcijas, saglabājot izcilo novadnieku radošo mantojumu un apliecinot viņu zīmīgo devumu Latvijas mākslas vēsturē.

Kopumā Rotko muzeja krājumu veido vairāk nekā sešsimt autoru radīti mākslas darbi glezniecībā, grafikā, keramikā, tēlniecībā, tekstilā, fotogrāfijā un elektroniskajā mākslā. Krājuma vērtību skaitliskais daudzums un mākslinieciskā dažādība ļauj veidot konceptuāli daudzveidīgus izstāžu projektus Latvijas un ārvalstu kultūrvietās.